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Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？

A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻(xiàn)選擇合適的內(nèi)參。對于一些無法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？

A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計引物。

Q: 絕對定量與相對定量有什么區(qū)別？

A：絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。絕對定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。

Q: 每個反應(yīng)管中可以加入多少種探針？

A：每個反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計等幾個方面。

首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如激光管-CCD類型對于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒有限制的。如果信號的采集要通過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以ABI公司的儀器為例，7900和7700是激光-全波長檢測的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。

其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長既相對靠近又不能靠得太近，既保證信號激發(fā)的效率又保證信號不重疊干擾，能夠區(qū)分清楚。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達(dá)到每組4到5種熒光的水平。

第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計和選用的探針類型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種熒光，對于4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣做），還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。

第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內(nèi)對照，3色也就足夠了。

最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度，二是節(jié)省反應(yīng)成本。同時測定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時加入8-10條引物。在引物設(shè)計的時候要考慮到盡量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾，平衡各對引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花費(fèi)大量時間、人力和物力來篩選最佳引物組合、優(yōu)化反應(yīng)條件。如果實(shí)驗(yàn)規(guī)模不大，在總體上可能反而不合算。

在實(shí)際應(yīng)用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最優(yōu)化。比較切合實(shí)際的是2到3重反應(yīng)，引物和探針的設(shè)計不太困難，反應(yīng)條件的優(yōu)化也不太麻煩，同時降低了成本。

Q: 什么是雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法？

A：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指將內(nèi)參基因及目的基因分別稀釋5個點(diǎn)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確保擴(kuò)增效率，再根據(jù)絕對定量的數(shù)據(jù)計算差異表達(dá)情況。